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申请人：
广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院 广州中医药大学第二临床医学院 广东省中医药科学院)
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当前专利权人：
广东省中医院(广州中医药大学第二附属医院 广州中医药大学第二临床医学院 广东省中医药科学院)
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申请号：
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摘要：
本发明公开了一种从尿液中分离黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的方法。该方法步骤为：尿液样品经两次AB‑8大孔吸附树脂分离后再用ODS开放柱对代谢物进行富集；再用SephadexLH20凝胶柱纯化；所得流份用Agilent1200型制备液相制备目标产物，并用LC‑MSn分析验证对其结构进行鉴定。本方法分离提取了体内黄柏碱代谢产物，并确认其化学结构及定量分析，为分析其裂解规律，转化关系，体内药代动力学研究，药理作用机理研究提供了可行性条件及实验依据。具有操作简单、成本低、效率高等优点。
主权项：
1.一种从尿液中分离黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)AB-8大孔吸附树脂初步分离：除杂质后的黄柏碱代谢尿样，用1倍尿样体积的AB-8大孔吸附树脂处理，上样流速为2BV/h；用2BV水洗脱，再用4BV的20％乙醇洗脱，收集流份，用LC-MSn法检测，区分含有黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷的流份和含有黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷、黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷混合物的流份，并分别合并以上流份，浓缩至1/10体积，保存备用；(2)AB-8大孔吸附树脂进一步分离：1)黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷浓缩液用AB-8大孔吸附树脂层析柱处理，1BV水洗脱杂质，2BV的20％乙醇再洗脱，流份采用LC-MSn法检测，合并目标流份，浓缩至1/10体积，保存备用；2)黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷、黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷混合物浓缩液用AB-8大孔吸附树脂层析柱处理，2BV水洗脱杂质，4BV的20％乙醇再洗脱，流份采用LC-MSn法检测，合并目标流份，浓缩至1/10体积，保存备用；(3)ODS开放柱对代谢物进行富集：1)将步骤(2)所得的黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷目标流份，用ODS层析柱处理，上样量为柱体积的1/10，用1.5BV的10％甲醇水洗脱，流份采用LC-MSn法检测，合并目标流份，浓缩至1/10体积，保存备用；2)将步骤(2)所得的黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷、黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷混合物目标流份，用ODS开放柱处理，上样量为柱体积的1/10，用2BV的10％甲醇水洗脱，再用3BV的20％甲醇水洗脱，流份采用LC-MSn法检测，分别合并分离所得的黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷及黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷流份，浓缩至1/10体积，保存备用；(4)SephadexLH20凝胶柱对代谢产物进行纯化：1)将步骤(3)所得的黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷浓缩液用SephadexLH20凝胶柱处理，用50％甲醇水洗脱，采用LC-MSn法分析，流份浓缩至1/10体积，保存备用；2)将步骤(3)所得的黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷及黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷浓缩液，分别用SephadexLH20凝胶柱处理，用50％甲醇水洗脱，采用LC-MSn法分析，合并流份，浓缩至1/10体积，保存备用；(5)Agilent1200型制备液相制备代谢产物：黄柏碱-2,11-O-D-二葡萄糖醛酸苷制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水，体积比5:95；进样时间为15min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间为4-4.5min，RT＝4.25min，制备后合并所有收集液浓缩至干，用超纯水溶解，于-80℃保存，冷冻干燥，得目标产物；黄柏碱-2-O-D-葡萄糖醛酸苷制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水，体积比25:75；进样时间为16min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间为12.6-13.1min，RT＝12.8min，制备后合并所有收集液浓缩至干，用超纯水溶解，于-80℃保存，最后采用冷冻干燥处理，得目标产物；黄柏碱-11-O-D-葡萄糖醛酸苷制备条件：采用菲罗门Polar-RP-80A半制备柱，流速为4mL/min；流动相为甲醇：超纯水，体积比25:75，进样时间为12min，检测波长为234nm，进样量80μL，收集时间8.6-9.5min，RT＝9min，制备后合并所有收集液浓缩至干，超纯水溶解，于-80℃保存，冷冻干燥，得目标产物；(6)黄柏碱葡萄糖醛酸结合物的结构鉴定：步骤(5)所得产物，用40％乙腈水溶解，进行LC-MSn分析验证，确认为对应目标产物。
