摘要:
目的 建立荧光环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)检测化脓性链球菌毒力基因sdaB的方法。方法 根据GenBank公布的化脓性链球菌sdaB基因保守序列(GenBank:69901515),使用引物设计软件Primer Explorer V5.0获得LAMP引物。在LAMP体系中加入荧光染料,对引物、MgSO4、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleosidetriphosphate, dNTP)、Bst DNA聚合酶的使用浓度进行了筛选,MgSO4浓度范围为0~12 mmol/L、甜菜碱浓度范围为0~2.4 mol/L、dNTP浓度范围为0.2~2μmol/L、上游内部引物(forward inner primer, FIP)和下游内部引物(backward inner primer, BIP)浓度范围为0.2~2μmol/L、上游外部引物(forward outer primer, F3)和下游外部引物(backward outer primer, B3)浓度范围为0.2~0.4μmol/L、Bst DNA聚合酶浓度范围为0.16~0.96 U/μL、荧光染料浓度范围为0.2~2μmol/L。以优化后体系,在ABI7500实时荧光定量PCR分析仪上评估方法学特异性和最低检出限,检测了13种标准菌株包括A群链球菌、B群链球菌、C群链球菌、G群链球菌、肺炎链球菌、草绿色链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、淋病奈瑟菌、嗜酸乳杆菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌,最后检测了103例临床样本。结果 反应体系以25μL为宜,包含25μmol/L荧光染料0.8μL、100 mmol/L MgSO41μL、5 mol/L甜菜碱6μL、25 mmol/L dNTP 1.4μL、20μmol/L FIP和BIP各2μL、20μmol/L F3和B3各0.5μL、8 U/μL Bst DNA聚合酶1μL和2μL模板,去离子水补足,63℃反应45 min即可完成;最低检出限为500 pg/μL;检测12株非化脓性链球菌株,均为阴性结果。103例临床样本结果与培养法比较,临床灵敏度为100.0%(16/16),特异性为96.6%(84/87)。结论 本研究检测化脓性链球菌的特异性和灵敏度较好,且操作简单,能满足临床需求,适宜现场检测及基层推广。