目的：优化高效液相色谱串联质谱法（LC‐MS／MS）测定血清游离雌三醇（uE3）的前处理方法。方法以活性炭吸附血清为研究基质，通过加入已知量的雌三醇（E3）标准品及E3‐2‐3‐4‐13C3内标，在LC‐20ADXR高效液相色谱系统和API5500串联四级杆质谱仪上对E3检测的色谱条件、质谱条件及萃取条件等进行优化。结果色谱条件：选用菲罗门Knietex色谱柱（100．0mm×2．1mm，2．6μm）；有机相为甲醇，水相为0．1mmol／L氟化铵水溶液，8min梯度洗脱。质谱条件：选用电喷雾（ESI）负离子模式和多反应监测（MRM）模式分析，选择质荷比（m／z）287→m／z145作为E3的定量离子对，m／z287→m／z171作为定性监测离子对；选择m／z290→m／z148作为内标的定量离子对，m／z290→m／z174作为定性监测的离子对。萃取条件：萃取剂为正己烷／乙酸乙酯（50／50，v／v），样品与萃取剂的比例为1∶2，萃取率可达85．71％。结论E3检测的色谱条件、质谱条件、萃取条件已得到全面优化，为后续建立LC‐MS／MS测定人血中uE3的参考方法打下良好基础。