摘要：
背景:目前大多采用Adeasy系统来构建和包装腺病毒载体,整个过程需要多次酶切,连接和转化筛选,并且在BJ183菌中的重组阳性率很低,还可能存在假阳性的可能,整个过程耗时、繁琐.目的:应用Gateway技术较快速构建大鼠LIM矿化蛋白1基因重组腺病毒载体.方法:从SD大鼠成骨细胞内提取总RNA,并设计LMP-1特异性引物进行RT-PCR,获取LMP-1基因后利Invitrogen公司的TOPO定向克隆技术创建入门克隆pENTR/D-LMP-1,转化TOP10细菌后挑取阳性克隆摇菌提取质粒,入门克隆再与表达载体pAD/CMV/V5-DEST进行同源重组反应得到病毒载体pAD/CMV/V5-LMP-1,转化细菌后挑选阳性克隆摇菌提取重组病毒质粒,用Pac Ⅰ内切酶线性化后用转染293A细胞后得到重组腺病毒载体.将目的基因与Genebank中LMP-1(基因号:AF095585)一致性BLAST比较,并观察重组腺病毒载体pAd-LMP-1的表达.结果与结论:总RNA后电泳结果显示所提RNA完整,RNA纯度符合要求.成功获取大鼠LMP-1基因,入门质粒与病毒表达质粒经过酶切鉴定以及测序证明,目的基因Genebank中LMP-1(基因号:AF095585)作BLAST比较,发现系列一致,没有突变.构建出来的腺病毒载体载体能在293A细胞中包装成功.提示利用Gateway技术构建LMP-1重组腺病毒载体相对简单、快捷地获得pAd-LMP-1.
